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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
FACULDADE DE NUTRIÇÃO
MESTRADO EM NUTRIÇÃO

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE MICROENCAPSULADOS DE
PRÓPOLIS VERMELHA

AMALIA LUISA IVO ALBUQUERQUE

MACEIÓ-2015

AMALIA LUISA IVO ALBUQUERQUE

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
MICROENCAPSULADOS DE PRÓPOLIS VERMELHA
Dissertação
apresentada
à
Faculdade
de
Nutrição
da
Universidade Federal de Alagoas
como requisito à obtenção do título
de Mestre em Nutrição.

Orientador(a): Prof. Dr. Irinaldo Diniz Basílio Júnior
Escola de Enfermagem e Farmácia/ Faculdade de Nutrição
Universidade Federal de Alagoas
Co-Orientador(a): Prof(a). Dr(a) Maria Cristina Delgado da Silva
Faculdade de Nutrição
Universidade Federal de Alagoas

MACEIÓ-2015

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Bibliotecário Responsável: Helena Cristina Pimentel do Vale
A345a

Albuquerque, Amalia Luisa Ivo.
Atividade antimicrobiana de microencapsulados de própolis vermelha /
Amalia Luisa Ivo Albuquerque. – 2016.
71 f. : il.
Orientador: Irinaldo Diniz Basílio Júnior.
Coorientadora: Maria Cristina Delgado da Silva.
Dissertação (Mestrado em Nutrição) – Universidade Federal de Alagoas.
Faculdade de Nutrição. Programa de Pós-Graduação em Nutrição. Maceió,
2015.
Inclui Bibliografia.
1. Própolis vermelha. 2. Microencapsulados. 3. Flavonoides. 4. Atividade
antimicrobiana. I. Título.
.

CDU: 612.39: 543.645.9

DEDICATÓRIA

Eu dedico este trabalho aos meus pais, Eli e Junia, por terem permanecido ao
meu lado, me incentivando a percorrer este caminho, por compartilharem as
angústias e dúvidas, e por estarem sempre presentes em momentos difíceis.
Sem eles nada disso seria possível.

AGRADECIMENTOS

Sou grata ao meu Deus, pelo dom da vida, e pela fé para encarar com serenidade
as dificuldades do cotidiano. Obrigada, Senhor!
Aos meus pais, Eli e Junia, pelo amor e apoio em minha aventura pela ciência.
Obrigada por serem sempre uma luz no fim do túnel e por serem os maiores
exemplos que tive na vida.
Ao meu esposo, Victor, por sempre oferecer palavras de incentivo e conforto nos
dias mais difíceis. E ao Fidel, nosso filho de quatro patas, que sempre se mostrou
fiel.
À minha família pelo amor e compreensão e por serem para mim exemplos de
honestidade e respeito, aos quais seguirei por toda minha vida. Em especial, aos
meus irmãos queridos, Felipe e Rebecca, e aos meus sobrinhos, Guilherme,
Marília, Isabel e Heitor, pelo carinho e pelas alegrias que me proporcionaram.
Também agradeço a minha vovó Amalia, pela ternura e pelos ensinamentos.
À minha orientadora, Maria Cristina Delgado, que desde a graduação com
paciência e dedicação me passou seus conhecimentos para a pesquisa e para a
vida, e sempre me incentivou a buscar o meu melhor. Obrigada por ter me
aceitado como sua aluna por todos esses anos.
Ao meu orientador, Irinaldo Diniz, que confiou no meu trabalho e aceitou me
orientar, fazendo isto sempre com toda paciência.
Aos Estagiários do Laboratório de Controle da Qualidade de Alimentos e ao
Cantídio, nosso técnico, pelo companheirismo e ajuda nas análises.
À Érika Nataly, bolsista de iniciação científica, que foi mais do que uma parceira
nas pesquisas e se tornou grande amiga para a vida. Meu muito obrigado!
A todos meus amigos, que tornaram o caminho mais fácil, sempre trazendo
alegrias ao meu cotidiano. Agradeço também pela compreensão da minha
ausência, em vários momentos.
Agradeço também a todos os amigos de mestrado que compartilharam comigo
conhecimento, e angústias, me fazendo entender que não estava sozinha, em
especial aos amigos Victor Carnaúba, Wanessa Pereira e Juliana Morais, que
tornaram essa caminhada mais leve.

Aos professores da Faculdade de Nutrição (FANUT) e Faculdade de Farmácia
(ESENFAR), em especial, ao professor Ticiano, com seus ensinamentos que
foram fundamentais para execução desta pesquisa.

Ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição (PPGNUT), em especial à Amanda,
por ser sempre prestativa e solícita.
À CAPES, pela concessão da bolsa que me viabilizou a participação como
discente desse programa.
Agradeço aos professores Ângela Froehlich e Ticiano Gomes por terem aceitado
participar de minha banca e por todas as contribuições ao trabalho.
À todos que, de alguma forma, colaboraram para este trabalho ser realizado.
Finalizando, essa conquista não é só minha; ela também é de cada um vocês.

Com amor,
à todos, agradeço!

RESUMO GERAL

A comercialização de produtos obtidos da abelha (Apis melífera) como o mel e a
própolis vem se tornando frequente no Brasil, visivelmente perceptível com a
crescente implantação de microindústrias de produtos à base de mel e própolis. O
uso popular cada vez mais crescente de própolis e seus derivados com ação
antimicrobiana, anti-inflamatória, antiviral, anticarcinogênica e imunomodulatória
vêm demonstrando o grande poder terapêutico. Em decorrência disso, novos
produtos contendo própolis estão sendo desenvolvidos, tais como, os
microencapsulados. A depender do método empregado, tais microencapsulados
podem resultar em um produto final com características negativas. Diante do
exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil microbiológico de
microencapsulados da própolis vermelha obtidas pela técnicas de secagem spraydrying e liofilização. A própolis vermelha foi obtida de apiários localizados na
região de mangue do município de Marechal Deodoro / AL. A amostra foi coletada
no período de fevereiro a março do ano 2012. A partir do extrato, foram
preparadas 4 formulações que variaram na quantidade de extrato etanólico de
própolis vermelha, bem como em proporções diferentes de excipientes. Duas
técnicas de secagem (spray-drying e liofilização) foram empregadas, resultando
em 8 amostras de microencapsulados, porém, destas, foram escolhidas 4
formulações (duas de cada técnica de secagem) para realizar os testes. Para
avaliação da atividade antimicrobiana, foram realizadas as determinações do teor
de Concentrações Inibitória e Bactericida Mínimas (CIM e CBM) através da
técnica de microdiluição em caldo frente à cepas padrão de Staphylococcus
aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25922), e Listeria monocytogenes
(ATCC 19115). Os biomarcadores da própolis vermelha foram identificados
usando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplado ao detector de
Ultra-Violeta. Os microencapsulados apresentaram atividade antimicrobiana para
todos os microrganismos estudos, porém com diferenças na CIM. Bactérias Gram
positivas foram mais susceptíveis que bactérias Gram negativas. Os
cromatogramas obtidos pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência do
extrato bruto e das formulações a base de própolis vermelha demonstraram uma
composição química complexa, com vários picos em diferentes tempos de
retenção. Os microencapsulados testados podem ser considerados candidatos a
otimização de amostras a base de própolis vermelha. Tais resultados permitirão
um controle de qualidade e, até uma futura padronização de produtos naturais e
nutracêuticos, a fim de obter produtos com constância de composição e
propriedades alimentícias adequadas.

PALAVRAS-CHAVE: Própolis
atividade antimicrobiana.

vermelha,

microencapsulados,

flavonoides,

ABSTRACT

The marketing of products obtained bee (Apis mellifera) as honey and propolis has
become common in Brazil, visibly noticeable with the increasing deployment of
microindústrias of products based on honey and propolis. The popular use everincreasing propolis and their derivatives with antimicrobial, anti-inflammatory,
antiviral, immunomodulatory and anticarcinogenic have demonstrated the great
therapeutic power. As a result, new products containing propolis are being
developed, such as the microencapsulated. Depending on the method used, such
microencapsulated may result in a final product with negative characteristics.
Given the above, this study aimed to evaluate the microbiological profile of the
microencapsulated propolis obtained by drying techniques spray-drying and freeze
drying. The propolis was obtained from apiaries located in the mangrove area of
the municipality of Marechal Deodoro / AL. The sample was collected from
February to March 2012. From the extract were prepared 4 formulations varying
the amount of ethanol extract of propolis, as well as different proportions of
excipients. Two techniques drying (spray drying and freeze drying) were used,
resulting in 8 samples of microencapsulated However, these, 4 were selected
formulations (each two drying technique) to perform the tests. To evaluate the
antimicrobial activity, the determination was made of the content of Inhibitory
Concentrations and Minimum Bactericidal (MIC and MBC) through the
microdilution technique in broth front of the standard strains of Staphylococcus
aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25922), and Listeria
monocytogenes (ATCC 19115). Biomarkers of propolis were identified using highperformance liquid chromatography (HPLC) coupled to Ultra-Violet detector. The
microencapsulated presented antimicrobial activity for all microorganisms studies,
but with differences in the CIM. Gram positive bacteria were more susceptible than
Gram negative bacteria. The chromatograms obtained by liquid chromatography of
high efficiency in crude extracts and formulations propolis base showed a complex
chemical composition, with several peaks at different retention times. The
microencapsulated tested can be considered candidates for optimization samples
propolis base. These results will allow a quality control and, until a future
standardization of natural products and nutraceuticals, in order to obtain products
with composition of consistency and appropriate nutritional properties.

KEYWORDS: Red propolis, microencapsulated, flavonoids, antimicrobial activity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página

Artigo II: Artigo de Resultados
Figura 1

Preparo das formulações.

41

Figura 2

Atomização (spray-drying) das formulações a base de própolis
vermelha.

42

Figura 3

Liofilização das formulações a base de própolis vermelha.

43

Figura 4

(F1SP), (F2 SP), (F3 SP) e (F4 SP): Pós Atomizados (Spray Dryer)

47

Figura 5

(F1L), (F2L), (F3L) e (F4L): Pós Liofilizados.

48

Figura 6

Padrões autênticos identificados de isoflavonas utilizados no
estudo.

49

Figura 7

Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes no extrato bruto
da própolis vermelha. (A) 249nm, (B) 275nm, (C) 281nm e (D)
366nm.

49

Figura 8

Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na Formulação
1 (Spray-Dryer). (A) 249nm, (B) 275nm, (C) 281nm e (D)
366nm.

50

Figura9

Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na Formulação
2 (liofilizada). (A) 249nm, (B) 275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.

51

Figura10

Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na Formulação
4 (Liofilizada). (A) 249nm, (B) 275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.

51

Figura11

Halos de inibição das formulações. (A) F1SP frente à S. aureus;
(B) F1L frente à E. coli; (C) F2 SP frente à L. monocytogenes; (D)
F2 L frente à S. aureus.

Figura12

Resultados após adição
determinação da CIM.

de

revelador

resazurina

para

57

59

LISTA DE TABELAS

Página

Artigo II: Artigo de Resultados

Tabela 1

Percentual em massa dos excipientes nas formulações.

40

Tabela 2

Parâmetros do método cromatográfico.

44

Tabela 3

Proporção do solvente utilizado no sistema gradiente de
eluição da fase móvel.

44

Tabela 4

A
Concentração
de
flavonoides
(µg/mL)
microencapsulados e extrato da própolis vermelha.

nos

52

Tabela 5

Formulações liofilizada (F1L) e atomizada (F1SP) em
comparação com a tintura de própolis vermelha frente à S.
aureus, E. coli e L. monocytogenes.

53

Tabela 6

Formulações liofilizada (F1L) e atomizada (F1SP) em
comparação com a tintura de própolis vermelha frente à S.
aureus, E. coli e L. monocytogenes.

54

Tabela 7

Concentração Inibitória Mínima dos microencapsulados
obtidos pelo liofilizador e spray-dryer.

58

Tabela 8

Concentração Bactericida Mínima dos microencapsulados
obtidos pelo liofilizador e spray-dryer.

60

NOMENCLATURA

AL- Alagoas
ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC- American Type Culture Collection
BHI- Brain Heart Infusion
CBM- Concentração Bactericida Mínima
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLAE- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EC- Escherichia coli
HPLC- High Performance/Pressure Liquide Chromatography
µL- Microlitro
MRS- Man, Rogosa e Sharpe
pH- Potencial de Hidrogênio
ID- Indicação Geográfica
SEBRAE- Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas
TSB- Tryptic Soy Broth
UFC- Unidades Formadoras de Colônias
UV- Ultravioleta

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................14
2. OBJETIVOS.................................................................................................16
2.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................16
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................16

3. COLETÂNEA DE ARTIGOS........................................................................18
ARTIGO I: Artigo de Revisão.......................................................................19
RESUMO.........................................................................................................20
ABSTRACT.....................................................................................................21
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................22
2. DESENVOLVIMENTO.................................................................................23
2.1ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA...........................................................23
2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...............................................................24
2.3 ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA................................................................25
2.4 ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA...............................................................26
2.5 ATIVIDADE OFTALMOLÓGICA................................................................26
2.6 ATIVIDADE ANTIHIPERGLICÊMICA........................................................27
2.7 ATIVIDADE ANTI-HIPERTENSIVA............................................................27
3. CONCLUSÕES............................................................................................28
REFERÊNCIAS...............................................................................................29

ARTIGO II: Artigo de Resultados..................................................................34
RESUMO.........................................................................................................35
ABSTRACT.....................................................................................................36
1 INTRODUÇÃO..............................................................................................37
2 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................39
2.1 COLETA E ARMAZENAMENTO DA PRÓPOLIS VERMELHA DE
ALAGOAS........................................................................................................39

2,2 OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE PRÓPOLIS.......................40
2.3 PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROENCAPSULADOS DE
PRÓPOLIS VERMELHA DE ALAGOAS..........................................................40
2.3.1 Atomização das formulações – Spray Dryer......................................41
2.3.2 Liofilização das formulações...............................................................42
2.4 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS (CLAE-UV).........................................43
2.4.1 Preparo das amostras..........................................................................43
2.4.2 Condições do HPLC..............................................................................43
2.5 ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS................................................................45
2.5.1 Manutenção e estoque das cepas.......................................................45
2.5.2 Inóculo...................................................................................................45
2.5.3 Avaliação Preliminar da atividade antimicrobiana............................45
2.5.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos
microencapsulados.......................................................................................46
2.5.5 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos
microencapsulados de própolis vermelha..................................................46
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................47
3.1 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS (CLAE-UV).........................................48
3.2 ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS................................................................52
4 CONCLUSÃO...............................................................................................61
REFERÊNCIAS..............................................................................................62
CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................66
REFERÊNCIAS...............................................................................................68

14

1 INTRODUÇÃO GERAL

15

A resistência a agentes antibacterianos tem se tornado um importante
problema global. Dos dois milhões de pessoas que contraíram alguma doença de
origem bacteriana nos hospitais dos Estados Unidos da América a cada ano,
cerca de 70% dos casos envolvem cepas bacterianas que são resistentes a pelo
menos uma droga (CUSHINE; LAMB, 2005).
Em

resposta

a

resistência

bacteriana,

as

principais

indústrias

farmacêuticas, juntamente com as universidades, têm concentrado esforços em
isolar e identificar novos compostos com atividades antibacterianas (TAYLOR;
STAPLETON; PAUL, 2002). Os produtos naturais têm sido fontes valiosas para o
desenvolvimento desses novos compostos (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000),
permitindo a descoberta de agentes terapêuticos não somente para tratar
doenças infecciosas, mas também para tratar o câncer, imunodeficiências e
outras (CLARDY, WALSH, 2004).
Entre os produtos naturais, a própolis tem se destacado, tanto pelas suas
diversas propriedades biológicas (CHEN et al., 2003; NAGAOKA et al., 2003;
DUARTE et al., 2003; NAGAI et al., 2003; ASO et al., 2004; KUMASAWA;
HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004; HAYACIBARA et al., 2005; CASTRO et al.,
2007; ALENCAR et al., 2007; OLDONI, 2007), quanto pela sua aplicabilidade nas
indústrias de cosméticos e alimentos, utilizada como ingrediente na formulação de
vários produtos (MATSUDA, 1994).
A própolis é produzida pelas abelhas a partir de substâncias vegetais
coletadas das fontes botânicas presentes na proximidade do apiário. Existem
estudos relatando que a composição química da própolis pode variar de acordo
com a sazonalidade regional, o que pode influenciar o seu potencial de ação
(SFORCIN et al.,2000; CASTRO et al., 2007). A composição da própolis é reflexo
da flora utilizada pelas abelhas (BURDOCK, 1998; RUSSO et al., 2002), podendo
ser encontrada em tons que variam do amarelo-esverdeado, passando pelo
marrom-avermelhado ao negro (INOUE et al., 2007).
No Brasil, alguns tipos de própolis já foram caracterizados e classificados
pela coloração. Após o processamento e análise das amostras quanto à

16

aparência e coloração dos extratos, Park et al. (2000) classificaram as amostras
de própolis brasileira em doze tipos, analisando as características físico-químicas
e propriedades biológicas de material coletado em diferentes regiões brasileiras.
Recentemente, um novo grupo da Mata Atlântica de Alagoas foi identificado e
classificado como grupo 13, este apresenta uma potente ação biológica
(ALENCAR et al., 2007).
No entanto, apesar de suas propriedades terapêuticas importantes,
apresentam características organolépticas que dificultam a sua utilização e uma
das soluções alternativas para atenuar o sabor amargo e o odor forte, e ainda
desenvolver um produto intermediário que facilite a produção de produtos
acabados é a microencapsulação, que podem ser obtidos por spray-drying e
liofilização (Diário da Saúde- RS, 2010).
O desenvolvimento de produtos requer um controle de qualidade desde as
matérias-primas até a obtenção de um produto acabado. Ainda mais, quando
envolve produtos inovadores, como a obtenção de formulações à base de própolis
vermelha de Alagoas. E por se tratar de um produto inovador, os ensaios iniciais
devem ser extremamente rigorosos, para que as etapas complementares dos
estudos pré-clínicos microbiológicos sejam condizentes e, portanto sirvam de
estrutura base para outros ensaios decisivos para a liberação do produto para sua
comercialização (BRASIL, 2004a). Estes estudos serão importantes para
introduzir no mercado bioprodutos a base de própolis vermelha de Alagoas com
qualidade assegurada, pois será possível, por exemplo, monitorar a Concentração
Inibitória Mínima (CIM) das formulações, etapa esta significante para a realização
de futuros ensaios pré-clínicos in vivo.
Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi de desenvolver
formulações à base de própolis vermelha de Alagoas, e destas obter
microencapsulados através das técnicas de secagem por atomização e
liofilização. Além disso, caracterizar e avaliar a atividade antimicrobiana destes
produtos.

17

2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana de microencapsulados de própolis
vermelha de Alagoas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS


Padronizar a qualidade da matéria-prima própolis vermelha, seus produtos
intermediários e/ou o(s) bioprodutos;



Obter

microencapsulados

através

das

técnicas

de

secagem

por

atomização e liofilização;


Caracterizar, através de ensaios microbiológicos (Concentração Inibitória
Mínima e Concentração Bactericida Mínima), a atividade antimicrobiana
dos microencapsulados, bem como das tinturas;



Identificar a presença dos isoflavonóides nas formulações com própolis
vermelha através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV);



Determinar o perfil químico e microbiológico da melhor formulação de
microencapulados de própolis vermelha.

18

3 COLETÂNEA DE ARTIGOS

19

ARTIGO 1: Artigo de Revisão
ALBUQUERQUE, ALI; JUNIOR, IDB; SILVA, MCD. Propriedades terapêuticas da
Própolis: uma revisão de literatura narrativa.
Revista a que será submetido: A definir.

20

RESUMO

A utilização e abordagem de produtos naturais pela população sejam eles
alimentos

funcionais

ou

nutracêuticos,

como

fonte

de

produtos

saudáveis/terapêuticos, vem se tornando crescente em detrimento aos produtos
sintéticos. Própolis de Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apidae) é um produto da
colméia, elaborado a partir de exsudatos de resinas que as abelhas recolhem de
determinadas plantas. Ultimamente, a própolis vem sendo um dos principais
enfoques mundiais em pesquisas. Considerada um alimento funcional, a própolis
apresenta diversas substâncias que são responsáveis por muitas atividades
terapêuticas. A composição química da própolis é complexa e relacionada à
diversidade vegetal encontrada em torno da colméia. Embora a própolis seja
utilizada em medicina popular por milhares de anos, a falta de padrões que
avaliem de maneira precisa suas atividades farmacológicas, dificulta a
padronização de produtos comerciais que garanta sua eficácia e segurança
terapêutica para humanos e outros animais. Nesta revisão de literatura estão
expostos alguns desenvolvimentos recentes da pesquisa farmacológica da
própolis,

enfocando-se

as

atividades

anti-inflamatórias,

antimicrobianas,

antineoplásica, antiparasitária, antihiperglicêmica e antihipertensiva.

PALAVRAS-CHAVE: Própolis; Apis mellifera; propriedades terapêuticas.

21

ABSTRACT

The use and approach of natural products the population they are functional foods
or nutraceuticals, as a source of health / medical products, is becoming
increasingly over the synthetic products. Propolis of

Apis mellifera L.

(Hymenoptera, Apidae) is a product of the hive, drawn from exudates resin that
bees collect from certain plants. Lately, propolis has been one of the world
approaches research. Considered a functional food, propolis has several
substances that are responsible for many therapeutic activities. The chemical
composition of propolis is complex and related to plant diversity found around the
hive. Although propolis is used in folk medicine for thousands of years, the lack of
standards

to

assess

accurately

their

pharmacological

activities,

the

standardization complicates commercial products to ensure their efficacy and
safety for humans and other animals. In this review we are exposed some recent
developments in pharmacological research of propolis, focusing on up the antiinflammatory activity, antimicrobial, anticancer, antiparisitic, antihyperglycemic and
antihypertensive.

KEYWORDS: Propolis; Apis mellifera; therapeutic properties.

22

1. INTRODUÇÃO
A própolis é uma mistura complexa de material resinoso e balsâmico, que é
coletado de exsudados de árvores, flores, ramos, pólen e outras partes do tecido
vegetal, que estejam próximos do local onde está situada a colmeia, que é
misturado e processado com secreções salivares (MARCUCCI, 1995; SOUZA et
al., 2007).
É produzida pelas abelhas para as mais variadas funções na colmeia
(preenchimento de frestas, diminuição de aberturas de entrada e saída da
colmeia, mumificação de cadáveres de insetos, para impedimento de sua
decomposição e putrefação). Também é utilizada para cobrir as paredes internas
da colmeia e interior das células para defendê-las dos microrganismos, além de
reparar os favos estragados e consolidar os favos móveis (GHISALBERTI, 1979).
A composição de uma própolis é determinada principalmente pelas
características fitogeográficas existentes ao redor da colmeia (KUMAZAWA et al.,
2004). Entretanto, a composição da própolis também varia sazonalmente em uma
mesma localidade (SFORCIN et al., 2000). Variações na composição também
foram observadas entre amostras de própolis coletadas em uma mesma região,
por diferentes raças de Apis mellifera (SILICI; KUTLUCA, 2005).
A própolis brasileira é classificada em grupos de acordo com suas
características físico-químicas, até o momento, existem 13 grupos diferentes de
própolis, porém, acredita-se que, ainda há uma subestimação das variedades de
própolis, visto que a flora brasileira apresenta uma imensa diversidade, das quais
as abelhas podem coletar (PARK et al., 2000).
Geralmente, a própolis é composta por 50% de resinas e bálsamos, 30%
de cera, 10% de essência e óleos aromáticos, 5% de pólen, e 5% de outras
substâncias (contidas principalmente na resina), como ácidos alifáticos, ésteres,
ácidos aromáticos, ácidos graxos, carboidratos, aldeídos, aminoácidos, cetonas,
chalconas, diidrochalconas, terpenóides, vitaminas e minerais (ALMEIDA;
MENEZES, 2002).
Ultimamente, a própolis vem sendo um dos principais enfoques mundiais
em pesquisas. Considerada um alimento funcional, utilizado na medicina popular

23

desde os tempos remotos (AGUIAR et al., 2003), a cola das abelhas, como
também é conhecida, apresenta diversas substâncias que são responsáveis por
muitas atividades terapêuticas (KHAYYAL et al., 1993; VYNOGRAD et al., 2000;
SFORCIN et al., 2000, 2002; BAZO et al., 2002; CUNHA et al., 2004; MATSUI et
al., 2004; INOCUCHI et al., 2006; MARUYAMA et al., 2009; FONSECA et al.,
2010).
Os flavonoides são compostos fenólicos que compreendem um amplo
grupo de substâncias naturais não sintetizadas pelos animais (BEECHER, 2003;
MANACH et al., 2004). Cerca de 4.000 substâncias diferentes já foram listadas
como flavonóides, entre elas apigenina, quercetina, hesperetina, rutina, luteolina,
genisteina, daidzeina, antocianidina, kanferol etc. A presença e a concentração
destes compostos é utilizada como índice de qualificação de amostras de própolis
(LU et al., 2004). A presença de vários flavonoides e ácidos fenólicos em extratos
e tinturas de própolis mostram que estas substâncias agem sinergicamente em
ação

citostática/citotóxica,

anti-inflamatória,

cicatrizante,

antimicrobiana

e

antioxidante (AMOROS et al., 1992).
Apesar de os flavonoides serem os componentes da própolis mais
extensivamente estudados, eles não são os únicos responsáveis pelas suas
propriedades farmacológicas. Diversos outros compostos têm sido relacionados
com as propriedades medicinais da própolis (AWALE et al., 2005).
O presente trabalho teve como objetivo avaliar artigos científicos que
apresentam informações pertinentes acerca das atividades terapêuticas da
própolis brasileira, através de uma revisão.
2. DESENVOLVIMENTO
2.1 ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
A inflamação é um mecanismo de defesa, desenvolvido pelo próprio
organismo, a fim de combater infecções (bactérias, vírus e outros patógenos) e
agressões (cortes, queimaduras e feridas). Uma infecção, ou danos aos tecidos,
promove uma indução de uma cascata complexa de eventos, conjuntamente,
conhecida como resposta inflamatória, que é caracterizada por rubor, calor,
inchaço, dor e, em último caso, perda da função. E estes sintomas ocorrem em

24

virtude do aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular através dos
capilares, aos quais permitem que moléculas maiores (fatores do complemento,
anticorpos e citocina) deixem a corrente sanguínea e atravessem a parede
endotelial. Bem como há um movimento de leucócitos da corrente sanguínea para
os tecidos circundantes. Assim sendo, a elevação da temperatura e a vermelhidão
do tecido (eritema) é explicado pelo aumento do volume de sangue. Enquanto
que, o influxo de líquido nos capilares para os tecidos e sua acumulação
(exsudado) contribui para o inchaço do tecido (edema) (CALDER, 2006; KINDT et
al., 2008).
Alguns pesquisadores isolaram determinados compostos da própolis que
apresentam conhecida atividade anti-inflamatória. MIRZOEVA et al. (1996)
atribuíram esta propriedade à presença na própolis de compostos tais como o
ácido cafeico, a quercetina, a narigenina e o éster fenetílico do ácido cafeico
(CAPE). Esta atividade anti-inflamatória seria resultante da supressão da síntese
de prostaglandinas e de leucotrienos pelos macrófagos. A participação do CAPE
isolado da própolis, na inibição da síntese de prostaglandinas foi também
constatada por BORRELLI et al. (2002). Além destes compostos, KRO et al.
(1996)

caracterizaram

na

própolis

mais

outros

15

compostos

que,

conhecidamente apresentam esta atividade anti-inflamatória, entre eles o ácido
salicílico, a apigenina, o ácido felúrico e a galangina.
A inibição na geração de óxido nítrico por macrófagos é também apontada
como um dos fatores responsáveis pela atividade anti-inflamatória da própolis
(NAGAOKA et al., 2003). Entretanto, outros estudos indicam um aumento na
produção de H2O2 e NO por estas células (ORSI et al., 2000).
2.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Certamente a capacidade da própolis em inibir o crescimento de
microrganismos é a atividade farmacológica mais popularmente conhecida e
comprovada cientificamente. A despeito de suas distintas composições, amostras
de própolis da Europa são muito similares em relação à atividade antimicrobiana
quando comparadas com as amostras de própolis provenientes do Brasil
(POPOVA et al., 2004).

25

Várias pesquisas demonstram a atividade antimicrobiana, Castro et al.,
2009, em ensaios in vitro, concluíram que tanto o extrato etanólico quanto a
fração hexânica da própolis inibiam o crescimento de Staphylococcus aureus e
Streptococcus mutans, e sugeriram que a ação da atividade antimicrobiana ocorre
em virtude da presença da classe de benzofenonas e não aos ácidos graxos,
como alguns autores defendiam.
Diversos pesquisadores têm demonstrado a atividade antibacteriana
também em culturas de Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, S. enteritides
etc, entre eles BANKOVA et al. (1995), SERRA et al., (1995), MAZZUCO et al.
(1996) e PARK et al. (1998). Ensaios de antibiose com a própolis, frente a 10
bactérias Gram-positivas e 20 Gram-negativas, constataram que a atividade
antibacteriana da própolis é mais efetiva sobre as Gram-positivas (ANTUNES et
al., 1996).
Daugsch et al., 2008, corroboram em estudo in vitro sobre a atividade
antimicrobiana e, ainda ressaltaram que essa atividade é dependente da
composição química da planta utilizada pelas abelhas para a produção da
própolis.
Os possíveis mecanismos de atividade antimicrobiana dos compostos da
própolis são: inibição da motilidade bacteriana, atuar no potencial de membrana,
inibição da RNA-polimerase, desorganização da membrana citoplasmática,
citoplasma e parede celular e inibição da síntese proteica (MIRZOEVA et al.,
1997; TAKAISI-KIKUNI; SCHILCHER, 1994).
3.1 ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA
A procura de novas drogas para o controle dos diversos tipos de
neoplasias tem levado diversos pesquisadores a isolar compostos contidos em
amostras de própolis de diversas procedências.
Diversos compostos isolados da própolis apresentaram atividade inibitória
no crescimento de diversos tumores. MATSUNO (1995) constatou a atividade
inibitória de um diterpeno (PMS-1) sobre hepatocarcinoma humano. MITAMURA
et al. (1996), estudando o efeito do PMS-1 sobre tumor de pele sugeriu que esta

26

atividade esteja relacionada com a inibição na síntese de DNA destas células. O
CAPE isolado de própolis, apresentou atividade antiproliferativa sobre a linhagem
de hepatocarcinoma Hep3B, mas mostrou-se inócuo quando adicionado a
culturas primárias de hepatócito de camundongo (JIN et al., 2005).
Diversos outros compostos com atividade inibitória sobre crescimento de
tumores foram isolados em outros estudos, como de TAKAI et al. (1996),
MATSUNO et al. (1997), BANSKOTA et al. (1998), KIMOTO et al. (1998),
WEYANT et al. (2000), entre outros. Suzuki et al. (1996) e Orsolic et al. (2005)
isolaram compostos hidrossolúveis da própolis que, atuando sinergisticamente,
potencializaram

a

atividade

de

drogas

tumoricidas,

inibindo

assim

o

desenvolvimento de tumores acíticos de Ehrlich.
3.2 ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA
Define-se

parasitismo

como

associação

entre

seres

vivos

com

unilateralidade de benefícios, sendo o hospedeiro um dos associados e o
prejudicado na associação, pois fornece todo o aporte ao parasita, enquanto que,
a parasitose é o estado de infecção que agride o hospedeiro (NEVES, 1997).
Além dos medicamentos convencionais alopáticos (NEVES, 1997), os
produtos naturais são alternativos contra parasitas (BARBOSA et al., 2007).
Estudos mostram a utilização da própolis como possível fitomedicamento na
erradicação do agente causador.
Ayres et al., 2007, em estudo in vitro, pioneiro de investigação do efeito de
extratos etanólicos de própolis brasileira sobre formas promastigotas, amastigotas
extracelulares e macrófagos peritoneais infectados de Leishmania amazonenses
observaram que, esses extratos foram capazes de reduzir a carga parasitária e,
ainda, destacaram a importância da própolis vermelha de Alagoas, como o extrato
mais ativo contra L. amazonenses, em virtude da alta concentração de
benzofenonas prenilados.
3.3 ATIVIDADE OFTALMOLÓGICA
A promoção da saúde ocular e a prevenção de doenças visuais consistem
na forma mais fácil de reduzir o índice de cegueira evitável (TEMPORINI; KARA-

27

JOSÉ, 1995), porém, sabe-se que essa questão não é bem desenvolvida e
incentivada, e o tratamento com medicamentos é uma das alternativas não
invasivas que podem amenizar sintomas, e até curar (TEMPORINI; KARA-JOSÉ,
1995).
A própolis verde, em ensaios in vivo, foi capaz de inibir danos na retina,
após indução intravítrea por injeção de NMDA (Ácido N-Metílico-D-Aspártico) em
camundongos, já em estudos in vitro, este tipo de própolis conseguiu proteger
células ganglionares da retina (RGC-5) contra H2O2 (Peróxido de Hidrogênio) e
estaurosporina induzida, ambas responsáveis por ocasionar danos na retina
(como apoptose e necrose), e assim sendo, Inocuchi et al., 2006, indicaram que a
própolis inibe a lesão neuronal in vitro e in vivo.
3.4 ATIVIDADE ANTIHIPERGLICÊMICA
Nem sempre mudanças no estilo de vida são eficazes no tratamento da
diabetes, havendo, portanto, a necessidade de tratamento convencional, ou seja,
medicamentoso sintético e natural. Em estudos in vivo, realizados em ratos,
demonstraram um potente efeito antihiperglicêmico. Sendo o composto ativo
ácido 3,4,5-tri-cafeoilquínico como candidato de destaque que exerce o efeito e
mostra uma inibição específica na maltase (MATSUI et al., 2004). A maltase é
uma enzima responsável pela hidrólise de maltose em duas moléculas de glicose,
quando inibida retarda a digestão de carboidratos e, assim, controla os níveis de
glicose no sangue após as refeições (MELO et al., 2006).
3.5 ATIVIDADE ANTI-HIPERTENSIVA
Define-se Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) como condição clínica
provocada por diversos fatores de risco e caracteriza-se por níveis elevados e
sustentados de pressão arterial. Recomendações não medicamentosas, ou
melhor, mudanças na qualidade de vida são, sem dúvida, a melhor estratégia na
prevenção e, até, tratamento de hipertensão, porém, na maioria dos casos, faz-se
necessária implantação de medidas medicamentosas de caráter sintético (SBC,
2010) e, também, natural (BRASIL et al., 2008).

28

A

própolis

verde

apresentou

efeitos

anti-hipertensivos

em

ratos

espontaneamente hipertensos, por ação vasodilatadora, e foi verificado que os
componentes ativos são quatro flavonoides: dihidrocanferida, isoacuranetina,
betuletol e canferida (MARUYAMA et al., 2009).
3. CONCLUSÕES
Os vários resultados comprovados por trabalhos científicos mostram o
potencial da própolis para diversos usos e aplicações farmacológicas e confirmam
a

sua

eficácia,

principalmente

como

anti-inflamatório

e

antimicrobiano.

Atualmente, com o avanço das técnicas analíticas, têm sido realizado estudos
mais detalhados da constituição química da própolis e da atividade de seus
componentes.
Porém, o Brasil, como um dos maiores produtores de própolis do mundo,
ainda necessita de mais pesquisas que explorem e elucidem possíveis aplicações
dessa substância, sendo necessário o desenvolvimento de estudos que
relacionem sua composição química com a atividade biológica. Dessa maneira
seria possível correlacionar o tipo de própolis com a sua aplicação terapêutica e
na área alimentícia. Esta tarefa é indispensável para um mercado cada vez maior
e mais exigente em todo o mundo.
Portanto, ainda serão necessários muitos estudos envolvendo ensaios
clínicos in vivo capazes de determinar as doses corretas a serem administradas e
o real efeito da própolis em humanos.

29

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34

ARTIGO II: Artigo de Resultados
ALBUQUERQUE, ALI; JUNIOR, IDB; SILVA, MCD. Atividade antimicrobiana de
microencapsulados de própolis vermelha.
Revista a que será submetido: Boletim do Centro De Pesquisa e Processamento
de Alimentos (CEPPA)

35

RESUMO

A comercialização de produtos obtidos da abelha (Apis melífera) como o mel e a
própolis vem se tornando frequente no Brasil, visivelmente perceptível com a
crescente implantação de microindústrias de produtos à base de mel e própolis. O
uso popular cada vez mais crescente de própolis e seus derivados com ação
antimicrobiana, anti-inflamatória, antiviral, anticarcinogênica e imunomodulatória
vêm demonstrando o grande poder terapêutico. Em decorrência disso, novos
produtos contendo própolis estão sendo desenvolvidos, tais como, os
microencapsulados. A depender do método empregado, tais microencapsulados
podem resultar em um produto final com características negativas. Diante do
exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil microbiológico de
microencapsulados da própolis vermelha obtidas pela técnicas de secagem spraydrying e liofilização. A própolis vermelha foi obtida de apiários localizados na
região de mangue do município de Marechal Deodoro / AL. A amostra foi coletada
no período de fevereiro a março do ano 2012. A partir do extrato, foram
preparadas 4 formulações que variaram na quantidade de extrato etanólico de
própolis vermelha, bem como em proporções diferentes de excipientes. Duas
técnicas de secagem (spray-drying e liofilização) foram empregadas, resultando
em 8 amostras de microencapsulados, porém, destas, foram escolhidas 4
formulações (duas de cada técnica de secagem) para realizar os testes. Para
avaliação da atividade antimicrobiana, foram realizadas as determinações do teor
de Concentrações Inibitória e Bactericida Mínimas (CIM e CBM) através da
técnica de microdiluição em caldo frente à cepas padrão de Staphylococcus
aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25922), e Listeria monocytogenes
(ATCC 19115). Os biomarcadores da própolis vermelha foram identificados
usando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplado ao detector de
Ultra-Violeta. Os microencapsulados apresentaram atividade antimicrobiana para
todos os microrganismos estudos, porém com diferenças na CIM. Bactérias Gram
positivas foram mais susceptíveis que bactérias Gram negativas. Os
cromatogramas obtidos pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência do
extrato bruto e das formulações a base de própolis vermelha demonstraram uma
composição química complexa, com vários picos em diferentes tempos de
retenção. Os microencapsulados testados podem ser considerados candidatos a
otimização de amostras a base de própolis vermelha. Tais resultados permitirão
um controle de qualidade e, até uma futura padronização de produtos naturais e
nutracêuticos, a fim de obter produtos com constância de composição e
propriedades alimentícias adequadas.

PALAVRAS-CHAVE: Própolis
atividade antimicrobiana.

vermelha,

microencapsulados,

flavonoides,

36

ABSTRACT
The marketing of products obtained bee (Apis mellifera) as honey and propolis has
become common in Brazil, visibly noticeable with the increasing deployment of
microindústrias of products based on honey and propolis. The popular use everincreasing propolis and their derivatives with antimicrobial, anti-inflammatory,
antiviral, immunomodulatory and anticarcinogenic have demonstrated the great
therapeutic power. As a result, new products containing propolis are being
developed, such as the microencapsulated. Depending on the method used, such
microencapsulated may result in a final product with negative characteristics.
Given the above, this study aimed to evaluate the microbiological profile of the
microencapsulated propolis obtained by drying techniques spray-drying and freeze
drying. The propolis was obtained from apiaries located in the mangrove area of
the municipality of Marechal Deodoro / AL. The sample was collected from
February to March 2012. From the extract were prepared 4 formulations varying
the amount of ethanol extract of propolis, as well as different proportions of
excipients. Two techniques drying (spray drying and freeze drying) were used,
resulting in 8 samples of microencapsulated However, these, 4 were selected
formulations (each two drying technique) to perform the tests. To evaluate the
antimicrobial activity, the determination was made of the content of Inhibitory
Concentrations and Minimum Bactericidal (MIC and MBC) through the
microdilution technique in broth front of the standard strains of Staphylococcus
aureus (ATCC 25922), Escherichia coli (ATCC 25922), and Listeria
monocytogenes (ATCC 19115). Biomarkers of propolis were identified using highperformance liquid chromatography (HPLC) coupled to Ultra-Violet detector. The
microencapsulated presented antimicrobial activity for all microorganisms studies,
but with differences in the CIM. Gram positive bacteria were more susceptible than
Gram negative bacteria. The chromatograms obtained by liquid chromatography of
high efficiency in crude extracts and formulations propolis base showed a complex
chemical composition, with several peaks at different retention times. The
microencapsulated tested can be considered candidates for optimization samples
propolis base. These results will allow a quality control and, until a future
standardization of natural products and nutraceuticals, in order to obtain products
with composition of consistency and appropriate nutritional properties.

KEYWORDS: Red propolis, microencapsulated, flavonoids, antimicrobial activity.

37

1 INTRODUÇÃO
O uso indiscriminado e prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos
tem levado à seleção de microrganismos patogênicos mutantes resistentes a
esses compostos, tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma
alternativa eficaz e econômica (CRISAN et al., 1995).
Os produtos naturais têm sido fontes valiosas para o desenvolvimento
desses novos compostos (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000), permitindo a
descoberta de agentes terapêuticos não somente para tratar doenças infecciosas,
mas também para tratar o câncer, imunodeficiências e outras (CLARDY, WALSH,
2004).
A história do desenvolvimento das civilizações é rica em exemplos da
utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em
mecanismos de defesa (VIEGAS JR.; BOLZANI, 2006). O uso de plantas com fins
medicinais, para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das formas
mais antigas de prática medicinal da humanidade. Nos anos 90, foi divulgado pela
OMS (Organização Mundial de Saúde), que grande parte da população dos
países em desenvolvimento dependia das plantas como única forma de acesso
aos cuidados básicos de saúde (VEIGA JÚNIOR; PINTO, 2005).
Entre os produtos naturais, a própolis tem se destacado, tanto pelas suas
diversas propriedades biológicas (CHEN et al., 2003; NAGAOKA et al., 2003;
DUARTE et al., 2003; NAGAI et al., 2003; ASO et al., 2004; KUMASAWA;
HAMASAKA; NAKAYAMA, 2004; HAYACIBARA et al., 2005; CASTRO et al.,
2007; ALENCAR et al., 2007; OLDONI, 2007), quanto pela sua aplicabilidade nas
indústrias de cosméticos e alimentos, utilizada como ingrediente na formulação de
vários produtos (MATSUDA, 1994).
A própolis é uma substância resinosa produzida por abelhas Apis mellifera.
Esta substância é coletada de diversas partes da planta como brotos, botões
florais e exsudatos resinosos (PARK et al., 2002). Uma vez coletada, essa
substância é enriquecida com secreções enzimáticas e salivares (CASTALDO;
CAPASSO, 2002). A própolis é utilizada para cobrir paredes da colmeia,
preencher rachaduras e brechas, embalsamar insetos invasores mortos, reparar

38

favos e manter o interior da colmeia asséptico, principalmente o local de postura
da rainha (BANKOVA et al.,2000).
A própolis brasileira é classificada em grupos de acordo com suas
características físico-químicas, que é diretamente influenciada com a planta
utilizada pelas abelhas para coleta das resinas e exdudatos e, que,
consequentemente, influencia nas suas propriedades terapêuticas. Até a pouco
tempo atrás, existiam 12 grupos, recentemente foi descoberta uma nova
variedade de própolis, a própolis vermelha (grupo 13), que é encontrada em áreas
do manguezal do litoral e de margens de rios do nordeste, sendo esta provinda do
caule de Dalbergia ecastophyllum (DAUGSCH et al., 2008).
Particularmente,

a

própolis

vermelha

de

Alagoas

é

considerada

diferenciada, pois além de conter flavonoides em quantidade superior, contêm
substâncias exclusivas, tais como metil-o-arselinato, metil abietato, 2,4,6trimetilfenol, 7,4’-driidroxiflavona, homopterocarpina, medicarpina e 4’,7-dimetoxi2’-isoflavonol, conferindo um maior poder terapêutico em relação às demais
variedades (ALENCAR et al., 2007).
A propriedade antimicrobiana da própolis é amplamente relatada, sendo
destacada sua ação sobre Staphylococcus aureus (FERNANDES JUNIOR et al.,
1995, 1997, 2001 e 2003; PINTO et al., 2001); Streptococcus pyogenes (BOSIO
et al., 2000); Candida sp (SFORCIN et al., 2000; STEPANOVIC et al., 2003) e
sobre inúmeros outros microrganismos (BANSKOTA et al.,2001).
Apesar de amplo poder terapêutico e nutricional, em seu estado in natura
seu consumo é inaceitável, principalmente por apresentar sabor amargo. Por isso,
a própolis é processada e utilizada na indústria alimentícia e farmacêutica (PARK
et al., 2002), por exemplo, como ingrediente na produção de alimentos funcionais
e nutracêuticos.
Dentre os mais variados processamentos aplicados à matéria-prima natural
nas indústrias, a microencapsulação merece destaque, não apenas por proteger o
ingrediente ativo, mas também por separar os componentes incompatíveis e
reativos, reduzir a evaporação dos compostos voláteis, melhorar a solubilidade do

39

material encapsulado, auxiliar na incorporação de sistemas secos e atenuar
características organolépticas indesejadas (BORGOGNONI, 2005).
O processo de secagem por “spray”, também conhecido como secagem
por atomização ou pulverização, consiste em pulverizar uma solução líquida
exposta a uma corrente de ar quente não saturada que deverá remover sua
umidade, permitindo que o soluto que se encontrava diluído na solução seja
obtido em forma de pó. Este tipo de secagem é largamente utilizado nas
indústrias de alimentos, farmacêuticas e metalúrgicas (OLIVEIRA, 2007). Já a
liofilização é bastante empregada na secagem de substâncias termolábeis. Assim
sendo, permite secar sem provocar danos aos produtos (AULTON, 2005). É
também comumente empregada como método de encapsulação de material ativo
(ARAÚJO, 2011).
O controle de qualidade dos produtos intermediários e finais é
importantíssimo, pois após processamentos de secagens distintos é possível
comparar e compreender as consequências que um determinado processo
implica e ainda entender, por exemplo, a influência que certos excipientes
adicionados a formulações tem na produção de microencapsulados.
Ainda são escassos estudos que realizem monitoramento microbiológico
de microencapsulados à base de própolis vermelha de Alagoas, tornando
imprescindível um controle de qualidade destes produtos, tendo em vista a
perspectiva de padronização de produtos de origem natural e nutracêuticos com
constância de composição e propriedades terapêuticas reprodutíveis.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o perfil
microbiológico de microencapsulados da própolis vermelha obtidas pela técnicas
de secagem spray-drying e liofilização.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Coleta e armazenamento da própolis vermelha de Alagoas
A própolis vermelha foi obtida dos apiários localizados na região de
mangue do município de Marechal Deodoro / AL. A amostra foi coletada no
período de fevereiro a março do ano 2012, acondicionada em sacos plásticos

40

opaco, hermeticamente fechado e conservado sob refrigeração (entre -10 e -5°C)
até o momento das análises, visando evitar perdas dos constituintes voláteis.
2.2 Obtenção do extrato etanólico de própolis
A própolis bruta foi limpa, retirada todo e qualquer resíduo existente,
cortada em pequenos pedaços e pesada 300g do material. Essa amostra foi
submetida ao processo de maceração, com álcool etílico comercial 99°GL (5L) a
temperatura ambiente, com troca do solvente de 24 em 24 horas e em seguida foi
realizada filtração para obter o extrato etanólico de própolis (EEP). Após a
filtração o extrato obtido foi acondicionado em recipientes de vidro cobertos com
papel alumínio e devidamente identificados para conservação.
2.3 Preparo das formulações
As formulações foram preparadas e realizados os cálculos dos excipientes
levando em conta o percentual que cada um deveria apresentar no pó final
(Tabela 1).
Tabela 1. Percentual em massa dos excipientes nas formulações.
Excipientes

Formulações
F1 e F1L

F2 e F2L

F3 e F3L

F4 e F4L

EXP A

20%

40%

20%

40%

EXP B

5%

5%

EXP C

5%

5%

5%

5%

EXP D

5%

5%

5%

5%

F= Formulações spray dryer. FL= Formulações liofilizadas.

Os excipientes foram pesados em balança analítica e adicionados ao
extrato etanólico de própolis (EEP). O EXP A e o EXP C foram dissolvidos em
água a 37°C com o auxílio de um agitador mecânico modelo RW 20 Digital IKA ®

41

durante 5 minutos, em seguida adicionou-se o EEP, agitando-se por mais 5
minutos. O EXP B foi dissolvido em água a 70°C, adicionado ao EEP com os
excipientes contidos e agitados por 5 minutos. Por último dissolveu-se o EXP D
em água a 37°C sendo adicionado aos demais excipientes da formulação,
agitando-se por mais 5 minutos.

Figura 1. Preparo das formulações.
2.3.1 Atomização das formulações por Spray Dryer
Para obtenção dos microencapsulados, as formulações preparadas acima
foram atomizadas e secas em um mini Spray Dryer B-290 fabricado pela Büchi®,
Suiça). As condições utilizadas para obtenção dos microencapsulados foram
obtidas de acordo com os dados fornecidos pelo fabricante do equipamento e
através de relatos na literatura sobre secagem do EEP em Spray Dryer sendo,
portanto, selecionada as condições de 180°C para temperatura de entrada, 91°C
de temperatura de saída (não controlável), a aspiração ficou em 85% a 75% e a
alimentação em 5 mL/min.

42

Figura 2. Atomização (spray-drying) das formulações a base de própolis
vermelha.
2.3.2 Liofilização das formulações
As formulações também foram secas pelo método de liofilização realizado
no liofilizador modelo LD 1500 (Terroni ® equipaments), o qual compreende três
prateleiras dentro de uma câmara, um condensador a -43 ± 5°C e uma bomba de
vácuo. A pressão do sistema ficou abaixo de 300 µHg. O equipamento utilizado
na liofilização apresentou estabilidade de temperatura no condensador e pressão
baixa adequadas, sendo requisitos importantes durante o processo (Hatley e
Franks, 1991). As amostras foram acondicionadas em frascos protegidos da luz e
200mL foram adicionados nos frascos e previamente congelados por 72 horas a
temperatura de –20°C.

43

Figura 3. Liofilização das formulações a base de própolis vermelha.
2.4 Análises Cromatográficas (CLAE-UV)
Os biomarcadores da própolis vermelha foram identificados usando
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplado ao detector de UltraVioleta (Shimadzu).
2.4.1 Preparo das amostras
As amostras das formulações bem como a tintura de própolis vermelha
foram pesadas em balança analítica. A solubilização das amostras foi realizada
em álcool e tampão fosfato (pH 7,4), em razão de 1:1. As amostras foram
homogeneizadas em ultrassom até a completa solubilização das amostras. Após
solubilização alíquotas do sobrenadante aquoso foram filtradas em unidades
filtrantes de 0,20 m e transferidas para os vials de autoinjetor onde foram
injetados 20 µL. Todas as amostras foram injetadas contendo a mesma
concentração: 350mg/mL.
2.4.2 Condições do HPLC
Os cromatogramas foram obtidos num sistema cromatográfico da
Shimadzu contendo bomba de alta pressão (modelo LC-20AT), autoinjetor
(modelo SIL 20A), forno para condicionamento da coluna (modelo CTO- 20A),
detector de arranjo de diodo (modelo SPD-M20A) e uma controladora (CBM-20A)

44

com interfaceamento para o computador controlado por um software LC-solution
da Shimadzu.
As condições estão estabelecidas na Tabela 2.
Tabela 2. Parâmetros do método cromatográfico.
Características

Descrição

Fase móvel

Acetonitrila

Fluxo da fase móvel

0,8mL/min

Coluna

C18 Kinetex (150 x 4,6mm; 5µm XB)

Temperatura

33°C

Detector de UV

280nm

Volume de Injeção

20µL

A coluna cromatográfica recebeu um sistema gradiente de eluição da fase
móvel e a proporção do solvente utilizado encontra-se na Tabela 3.
Tabela 3. Proporção do solvente utilizado no sistema gradiente de eluição da fase
móvel.
Tempo (minutos)
0
2
5
8
11
14
17
20
24
28
32
36
40

Concentração acetonitrila (%)
30
30
36
42
48
52
52
56
62
68
50
30
30

45

2.5 Ensaios microbiológicos
Para

os

ensaios

microbiológicos

de

determinação

da

atividade

antimicrobiana foram utilizadas as cepas padrão provenientes da American Type
Culture

Collection

(ATCC):

Escherichia

coli

(ATCC

25922),

Listeria

monocytogenes (ATCC 19115) e Staphylococcus aureus (ATCC 25922). Estas
cepas foram adquiridas comercialmente.
2.5.1 Manutenção e estoque das cepas
As cepas foram reconstituídas e ativadas segundo instruções do fabricante. As
mesmas foram estocas em Tryptic Soy Broth (TSB) contendo glicerol à 20%, e
mantidas sob temperatura de congelamento até o momento das análises. Foram
realizadas 20 cópias de cada estirpe.
2.5.2 Inóculo
Os

tubos

contendo

as

cepas

de

microrganismos

congelados

permaneceram em temperatura ambiente até a total fusão da mistura. Os tubos
foram homogeneizados em vortex e o inóculo semeado, com alça de platina, por
esgotamento em placas contendo Agar Nutriente. Posteriormente, as placas
foram incubadas à 36ºC por 24 horas.
As

padronizações

das

suspensões

bacterianas

foram

preparadas

transferindo colônias das cepas isoladas em Agar Nutriente para tubos de ensaio
contendo solução salina a 0,85% e analisadas em aparelho fotométrico com
comprimento de onda ajustado em 625nmm ao qual foram consideradas aceitas
as absorbâncias que estiverem entre 0,08 a 0,1. Esta faixa de absorbância
corresponde a uma turbidez que coincide com a solução padrão de 0,5 da escala
de MacFarland, que por sua vez, corresponde a uma concentração bacteriana de
1,5 x108 UFC/mL.
2.5.3 Avaliação Preliminar da atividade antimicrobiana
Para a avaliação preliminar, a ação antimicrobiana foi determinada pelo
método de difusão em Agar. Para isso, com auxílio de um swab estéril, foi
semeado o inóculo, por superfície, em placas de Petri contendo Agar Mueller

46

Hinton. Sobre a superfície semeada e após a absorção pelo meio de cultura,
foram confeccionados discos de papel filme de 8mm de diâmetro. Em cada poço,
foram adicionados volumes diferentes das soluções-estoque da própolis vermelha
previamente preparadas.
Após a incubação das placas a 36°C por 16-18 horas, foi realizada a leitura
dos resultados, medindo-se os halos, em milímetro, formados ao redor dos poços
contendo as amostras e, incluindo o próprio diâmetro dos poços.
2.5.4

Determinação

da

Concentração

Inibitória

Mínima

(CIM)

dos

microencapsulados
A atividade antimicrobiana foi determinada pela Concentração Inibitória
Mínima (CIM) de crescimento bacteriano, segundo a metodologia da microdiluição
em caldo, proposta pelo National Committee for Clinical Laboratory Standard
(NCCL, 2003), utilizando para tal finalidade microplacas de 96 poços, com fundo
em “U”.
Cada placa foi destinada a uma única formulação e testada frente a três
bactérias

diferentes

(Staphylococcus

aureus,

Listeria

monocytogenes

e

Escherichia coli), sendo três colunas direcionadas a determinação de CIM, em
triplicata.
Previamente foram adicionados 100µL de caldo Muller Hinton em todos os
poços das microplacas. As concentrações das formulações que foram utilizadas
foram baseadas em ensaio preliminar de atividade antimicrobiana, ou seja,
baseadas nas zonas de inibição que conseguiram produzir, sendo adicionados
nos poços 100µL das diluições. Vale salientar que, inicialmente, foi preparada
uma solução estoque de todas as formulações e, em seguida, diluída em caldo
BHI para obtenção de tais concentrações. Em seguida, foram adicionados 30µL
do inóculo padronizado.
2.5.5

Determinação

da

Concentração

Bactericida

Mínima

(CBM)

dos

microencapsulados de própolis vermelha
A Concentração Bactericida Mínima foi determinada após o semeio por
esgotamento em Agar Muller Hinton de todas as amostras contidas nos poços

47

onde, porventura, não ocorreram crescimento bacteriano visível nas microplacas
após revelação com resazurina, bem como de amostras de poços que resultaram
em coloração intermediária (roxo), e posterior incubação à temperatura de 36ºC
durante 24 horas. A CBM foi considerada como a menor concentração das
formulações na qual não foi visualizado crescimento de colônias.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os microencapsulados de própolis vermelha apresentaram características
organolépticas de um pó com coloração alaranjado, vermelho intenso e marrom,
com cheiro característico de própolis. O extrato etanólico de própolis contido nos
microencapsulados apresentaram boa solubilidade em etanol e tampão fosfato
(pH 7,4), apesar de não solubilizar bem os excipientes.
Os pós obtidos pelo processo de liofilização das F1L, F2L, F3L e F4L
apresentaram-se macroscopicamente distintos, na umidade e aspecto cor, apesar
de possuírem a mesma concentração e os mesmos agentes encapsulantes das
formulações do spray dryer (Figura 4 e 5).

F1

F3

F2

F4

Figura 4. (F1SP), (F2 SP), (F3 SP) e (F4 SP): Pós Atomizados (Spray Dryer).

48

F1

F2
F2

F3

F4

L

L

Figura 5. (F1L), (F2L), (F3L) e (F4L): Pós Liofilizados.
Das 8 formulações que foram preparadas, foram escolhidas 4 formulações,
sendo duas provenientes de secagem por liofilização e duas por atomização para
realizar os testes subsequentes. As formulações foram escolhidas com base nas
características físico-químicas que apresentaram. As utilizadas para os testes
seguintes foram: F1L, F2L, F1SP e F2SP.
3.1 Análises Cromatográficas (CLAE-UV)
Os cromatogramas obtidos pela técnica de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) do extrato bruto e das formulações a base de própolis vermelha
demonstraram uma composição química complexa, com vários picos em
diferentes tempos de retenção. Os resultados estão de acordo com os trabalhos
de Silva et al. (2007) e Alencar et al. (2007), demonstrando que a própolis
vermelha se trata de um tipo diferenciado de própolis brasileira.
Neste trabalho, foram investigados os seguintes padrões autênticos de
flavonóides:

daidzeína,

pinocembrina,

liquirritigenina,

pinobanksina,

49

isoliquirritigenina,

formononetina,

biochanina

A

(Figura

6).

Figura 6. Padrões autênticos identificados de isoflavonas utilizados no estudo.
É possível observar, na figura 7, o perfil cromatográfico dos flavonoides
presentes na própolis vermelha. Observa-se a presença de 19 compostos
químicos. Esses isoflavonoides foram identificados no estudo de Silva et al.
(2007)

que comprovou

sua origem a partir de uma espécie da família

Leguminosae, Dalbergia ecastophyllum, podendo classificá-la como o 13° tipo de
própolis brasileira.

Figura 7. Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes no extrato bruto da
própolis vermelha. (A) 249nm, (B) 275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.

50

Pode-se observar nos cromatogramas da figura 7 que, nos comprimentos
de onda de 249, 260, 275, 291 e 366nm foi possível separar alguns compostos
fenólicos presentes na própolis vermelha, em especial a liquiritigenina (5,85
minutos), a pinobanksina (8,65 minutos), isoliquirritigenina (10,0 minutos) e
formononectina (10,47 minutos).
O perfil cromatográfico da F1SP encontra-se exposto na figura 8. Os
compostos fenólicos estão presentes na faixa de 5,81 minutos a 23,01 minutos.
Na formulação 1, foram identificados os compostos: liquirritigenina (5,8 minutos),
pinobanksina (8,5 minutos), isoliquirritigenina (9,96 minutos), formononectina (10,
43 minutos) e biochanina A (23,07 minutos).

Figura 8. Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na F1SP. (A) 249nm, (B)
275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.
O perfil cromatográfico da F1L encontra-se exposto na figura 9. Os
compostos fenólicos estão presentes na faixa de 5,81 minutos a 23,01 minutos.
Na formulação 4, foram identificados os compostos: liquirritigenina (5,81 minutos),
pinobanksina (8,59 minutos), isoliquirritigenina (9,97 minutos), formononectina
(10, 44 minutos) e biochanina A (23,01 minutos).

51

Figura 9. Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na F1 L. (A) 249nm, (B)
275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.
O perfil cromatográfico da F2SP encontra-se exposto na figura 10. Os
compostos fenólicos estão presentes na faixa de 5,80 minutos a 23,01 minutos.
Foram identificados os seguintes compostos: liquirritigenina (5,80 minutos),
pinobanksina (8,58 minutos), isoliquirritigenina (9,95 minutos), formononectina
(10, 44 minutos) e biochanina A (23,01 minutos).

Figura 10. Perfil cromatográfico dos flavonoides presentes na F2L. (A) 249nm, (B)
275nm, (C) 281nm e (D) 366nm.

52

Foi observado que os compostos fenólicos pinocembrina e daidzeína não
foram

identificados

em

nenhuma

das

formulações

avaliadas.

O

perfil

cromatográfico do extrato bruto da própolis vermelha mostrou-se semelhante às
formulações avaliadas, o que comprova a incorporação da própolis vermelha nas
formulações avaliadas. A tabela 4 demonstra a concentração de compostos
fenólicos tanto nos microencapsulados como no extrato da própolis vermelha.
Tabela 4. Concentração de flavonoides (µg/mL) nos microencapsulados e extrato
da própolis vermelha.
Composição

Liquirritigenina

Pinobanksina

Isoliquirritigenina

Formononetina

Biochanina A

Extrato

1,82

0,43

1,62

1,98

0,3936

F1SP

8,61

1,93

7,52

10,33

0,384

F1L

5,38

0,95

3,84

6,22

0,340

F2L

9,68

1,70

7,53

11,61

0,422

Devido a amostra F2SP ter absorvido umidade em excesso e ter ficado
higroscópica, não foi possível obter os resultados dos biomarcadores desta
amostra. Os processos de secagem mostraram que, durante o processo, ocorre
perda de excipientes por volatilização, sucção e/ou aderência nas paredes do
equipamento, resultando em teor maior de flavonoides em relação à concentração
de flavonoides do extrato.
Observou-se que, na F2L, todos os compostos fenólicos, com exceção da
pinobanksina, tiveram concentrações superiores das demais formulações
avaliadas (F1SP e F1L). Foram observados também altas concentrações de
formononetina em todas as amostras. De acordo com Moraes (2009), a
formononetina, um isoflavonoide com atividade estrogênica, antiradical e
antifúngica é encontrado em maior quantidade em amostras de própolis vermelha.
Essa isoflavona, quando consumida por mamíferos, é metabolizada em daidzeína
que é um isoflavonoide presente na soja usado no tratamento de câncer de mama
e próstata.
3.2 Ensaios microbiológicos
A atividade antimicrobiana da própolis é muito importante para a vida na
colmeia e independente da origem, todos os tipos de própolis apresentam essa
propriedade (BANKOVA et al., 1995). Tem sido reportado que a atividade

53

antibacteriana da própolis deve-se a efeitos sinergísticos entre flavonoides, ácidos
fenólicos e seus derivados que estão presentes majoritariamente na própolis.
Por meio do teste de difusão em agar foi possível avaliar, de forma
qualitativa, a atividade antimicrobiana da tintura e das formulações da própolis
vermelha. Nos ensaios realizados de teste de susceptibilidade para a confirmação
da atividade antimicrobiana das formulações a base de própolis vermelha de
Alagoas, observou-se que todas as formulações avaliadas apresentaram
atividade inibitória frente às bactérias testadas. Porém, a bactéria Escherichia coli
apresentou maior resistência à própolis vermelha, fato observado pela formação
de halos translúcidos inferiores aos demais microrganismos testados (Tabelas 4 a
7).
A solução utilizada como controle negativo não apresentou atividade contra
as bactérias testadas.
Tabela 5. Formulações liofilizada (F1L) e atomizada (F1SP) em comparação com a
tintura de própolis vermelha frente à S. aureus, E. coli e L. monocytogenes.
Halos de inibição
Formulações

Formulação
1L

Formulação
1SP

Concentrações

S. aureus

E. coli

L. monocytogenes

75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL
200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/mL
625 µg/mL

10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
12mm
12mm
12mm
14mm
14mm
15mm
15mm

8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
12mm

10mm
10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
11mm
12mm
13mm
14mm
15mm
15mm

75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL
200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/mL

10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
12mm
12mm
12mm
14mm
14mm
14mm

8mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm

10mm
10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
11mm
12mm
13mm
13mm
14mm

54

Tintura

625 µg/mL
75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL
200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/m
625 µg/mL

16mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
10mm
10mm
10mm
11mm
12mm
12mm
12mm

12mm
8mm
8mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
10mm
10mm

15mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
10mm
10mm
10mm
11mm
12mm
12mm
12mm

Tabela 6. Formulações liofilizada (F1L) e atomizada (F1SP) em comparação com a
tintura de própolis vermelha frente à S. aureus, E. coli e L. monocytogenes.
Halos de inibição
Formulações

Formulação
2L

Formulação
2SP

Tintura

Concentrações

S. aureus

E. coli

L. monocytogenes

75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL
200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/mL
625 µg/mL

10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
12mm
12mm
12mm
14mm
14mm
15mm
15mm

8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
12mm

10mm
10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
11mm
12mm
13mm
14mm
15mm
15mm

75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL
200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/mL
625 µg/mL
75 µg/mL
100 µg/mL
125 µg/mL
150 µg/mL

10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
12mm
12mm
12mm
14mm
14mm
14mm
16mm
8mm
8mm
8mm
10mm

8mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
12mm
8mm

10mm
10mm
10mm
11mm
11mm
11mm
11mm
12mm
13mm
13mm
14mm
15mm
8mm
8mm
8mm
10mm

55

200 µg/mL
225 µg/mL
250 µg/mL
312 µg/mL
375 µg/mL
437 µg/mL
500 µg/m
625 µg/mL

10mm
10mm
10mm
10mm
11mm
12mm
12mm
12mm

8mm
8mm
8mm
8mm
10mm
10mm
10mm
10mm

10mm
10mm
10mm
10mm
11mm
12mm
12mm
12mm

Independente do processo de secagem, todas as formulações foram mais
susceptíveis à S. aureus, L. monocytogenes e E. coli, respectivamente. Esses
resultados reforçam dados encontrados na literatura onde as amostras de
própolis, na forma de extratos etanólicos, possuem maior atividade inibitória para
as bactérias Gram-positivas, porem, alguns extratos podem apresentar inibição
moderada contra as bactérias Gram-negativas (MENEZES, 2005; UZEL et al.,
2005).
As F1 e F2 (liofilizadas e atomizadas) apresentaram uma atividade superior
quando comparada com a tintura de própolis, utilizada com o mesmo extrato bruto
para obtenção dos microencapsulados, o que já era esperado, visto que as
formulações submetidas aos processos de secagem apresentaram quantidades
superiores de compostos fenólicos, sendo estes indicados como os principais
responsáveis pelo poder antimicrobiano da própolis, juntamente com os
flavonoides e outros compostos orgânicos (BURDOCK et al., 1998).
Em um estudo de desenvolvimento e caracterização de sistemas de
liberação controlada de própolis intrabolsa periodontal, Bruschi (2006) avaliou a
atividade antibacteriana dos microencapsulados de gelatina contendo própolis de
Maringá- Paraná, obtidas por spray-drying, sendo constatado que, tintura à 30%
de própolis apresentaram halos de inibição frente a S. aureus, Pseudomonas
aeruginosa e E. coli, porém os microencapsulados não apresentaram nenhuma
atividade inibitória.
Silva et al. (2006) também encontraram resultados diferentes do presente
estudo. Os autores observaram que os extratos de própolis não inibiram o

56

crescimento de C. albicans e S. aureus, fato que indica que os compostos
bioativos das amostras analisadas no estudo não têm ação antimicrobiana.
O método de difusão em agar é influenciada pela difusão da substância
através de uma camada de agar solidificado contida em uma extensão tal que o
crescimento do microrganismo seja totalmente inibido em uma área ou zona ao
redor do reservatório contendo a substância bioativa (ESMERINO et al., 2004).
Portanto, foi observada a correlação entre o tamanho da zona de inibição e
a dose da substância em questão, ou seja, o halo formado é dose-dependente,
isto é, o tamanho do halo foi diretamente proporcional à concentração
antimicrobiana. À medida que se aumentou a concentração da própolis, halos
maiores foram gerados até que se esgotou sua capacidade de difusão. Ao
analisar a atividade antibacteriana de extratos de própolis sobre S. aureus, Park
et al. (1998) observaram que apenas concentrações acima de 30% de própolis
começaram a apresentar uma ligeira atividade (zona de inibição de 5 mm), e
quando utilizados extratos de 60 e 80%, a inibição do crescimento microbiano
aumentou consideravelmente (zona de inibição de 15 mm).
Ainda são escassos os estudos disponíveis na literatura sobre atividade
inibitória de microencapsulados a base de própolis. Além disso, há outro problema
que torna difícil correlacionar os resultados obtidos: por ser um produto natural,
fatores associados à técnica de extração, ao local de origem da própolis (flora),
estações do ano em que foi produzida, contaminantes presentes e até a
metodologia empregada podem ter influência sobre o teor de flavonoides,
compostos responsáveis pela maior ou menor atividade biológica (BIANCHINI &
BEBENDO, 1998).

57

Figura 11. Halos de inibição das formulações. (A) F1SP frente à S. aureus; (B) F1L
frente à E. coli; (C) F2 SP frente à L. monocytogenes; (D) F2 L frente à S. aureus.

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) é considerada como a menor
concentração de um agente antimicrobiano que impede o crescimento visível de
um microrganismo em testes de sensibilidade, sendo esse um parâmetro para
avaliar a potência in vitro da amostra testada (MENDES, 1997; CLSI, 2012).
A atividade antimicrobiana de extratos obtidos a partir de produtos
naturais é considerada muito importante em concentrações inferiores à 100µg/mL
(RIOS & RECIO, 2005).
Os resultados da Concentração Inibitória Mínima (CIM) das formulações
estão inseridos na tabela 7.

58

Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima dos microencapsulados obtidos pelo
liofilizador e spray-dryer.
CIM
Formulações

S. aureus

E. coli

L. monocytogenes

F1SP

85 µg/mL

500 µg/mL

167,5 µg/mL

F2SP

70 µg/mL

500 µg/mL

122 µg/mL

F1L

85 µg/mL

625 µg/mL

167,5 µg/mL

F2L

70 µg/mL

625 µg/mL

167,5 µg/mL

Tintura

135, 8 µg/mL

625 µg/mL

167,5 µg/mL

Foi observado que não houve diferença da CIM entre as técnicas de
secagem, exceto com a bactéria Escherichia coli na qual percebeu-se que as
F1SP e F2SP apresentaram menores concentrações que foram capazes de inibir o
crescimento desta bactéria (500µg/mL), em comparação com as F1L e F2L
(625µg/mL). Com L. monocytogenes também observou-se uma menor CIM na
F2SP. Portanto, apesar das diferentes concentrações de compostos fenólicos,
sendo a F2L a formulação que obteve as concentrações superiores, não foi
observado reflexo na atividade antimicrobiana em comparação com as demais
amostras.
Foi possível perceber, no presente estudo, que a susceptibilidade das
formulações frete às cepas apresentou a ordem: Staphylococcus aureus > Listeria
monocytogenes > Escherichia coli. Outros estudos já relataram esse fato
(VARGAS et al., 2004; STEPANOVIC et al., 2003), e algumas explicações foram
sugeridas pelos autores.
Suas ações são relacionadas, principalmente, ao efeito sinérgico entre
ácidos fenólicos, flavonoides e outros compostos orgânicos, especialmente,
pinocembrina, pinobanksina e galangina (BURDOCK et al., 1998), bem como, é
provável que os compostos fenólicos ativem ou aumentem a atividade de uma
enzima

(lisozima), responsável pela desestabilização

da

parede

celular

bacteriana, porém tais ações podem sofrer variações a depender da sensibilidade
de cada grupo de bactéria (ANDRADE, 2010). Essa sensibilidade está ligada,
provavelmente, as diferenças estruturais existentes entre as bactérias Gram-

59

positivas e Gram-negativas, em que, as Gram-positivas, no caso deste estudo por
S. aureus e L. monocytogenes são consideradas mais sensíveis à exposição de
produtos antibacterianos, até porque, estas apresentam apenas uma parede
celular composta, basicamente, de peptideoglicanos, enquanto que, de maneira
geral,

as

bactérias

negativas

são

mais

resistentes,

pois,

além

de

peptideoglicanos, apresentam ainda uma camada adicional conhecida como
membrana externa, rica em lipopolissacarídeos, dificultando assim a lise destas
bactérias (MIZOERVA et al., 1997).

Figura 12. Resultados após adição de revelador resazurina para determinação da
CIM.

Os três microrganismos utilizados no estudo foram sensíveis às
formulações a base de própolis vermelha. As Concentrações Bactericidas
Mínimas das amostras encontram-se descritas na Tabela 8. A F2SP foi a que
apresentou maior atividade com uma CBM de 67,93µg/mL, e as demais
formulações apresentaram as mesmas concentrações. Novamente, a bactéria E.
coli mostrou-se como o microrganismo mais resistente à ação da própolis,
seguida por L. monocytogenes e S. aureus, respectivamente.

60

Tabela 8. Concentração Bactericida Mínima dos microencapsulados obtidos pelo
liofilizador e spray-dryer.
CBM
Formulações

S. aureus

E. coli

L. monocytogenes

F1SP

135,87 µg/mL

1086,96 µg/mL

434 µg/mL

F2SP

67,93 µg/mL

1086,96 µg/mL

434 µg/mL

F1L

135,87 µg/mL

1086,96 µg/mL

434 µg/mL

F2L

135,87 µg/mL

1086,96 µg/mL

434 µg/mL

61

4 CONCLUSÃO
A liofilização e o spray-drying mostraram ser alternativas viáveis para o
encapsulamento da própolis sem reduzir a atividade antimicrobiana após o
processo, podendo contribuir para o mascaramento do sabor forte e amargo da
própolis.
Os resultados microbiológicos mostraram-se satisfatórios e promissores,
confirmando o fato de que a própolis é um potente inibidor de bactérias
patogênicas, sendo as gram-positivas mais sensíveis à ação da própolis. A F2SP
apresentou

menores

CIM,

com

inibição

de

S.

aureus

(70µg/mL),

L.

monocytogenes (122µg/mL) e E. coli (500µg/mL).
Os resultados da CLAE-UV mostraram que as formulações apresentaram
uma composição química complexa, com vários picos em diferentes tempos de
retenção. Foram identificados os compostos: liquirritigenina, pinobanksina,
isoliquirritigenina, formononectina e biochanina A. A cromatografia confirmou que
houve incorporação da própolis vermelha nas amostras avaliadas. A F2L
apresentou as maiores concentrações de isoflavonas.
Os microencapsulados testados podem ser considerados candidatos a
otimização de amostras a base de própolis vermelha. Tais resultados permitirão
um controle de qualidade e, até uma futura padronização de produtos naturais e
nutracêuticos, a fim de obter produtos com constância de composição e
manutenção das propriedades alimentícias.

62

REFERÊNCIAS
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66

CONSIDERAÇÕES FINAIS

67

O desenvolvimento de um alimento em pó, produzido a partir de própolis
vermelha de Alagoas pode ser utilizado tanto como fármaco ou como alimento,
pois a própolis apresenta várias funções biológicas, através de propriedades
antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória, anticancerígenos e anticariogênico.
Um bom conhecimento sobre tudo que envolve o produto final, desde a
composição química do produto in natura, passando pelos processos de
transformações empregados, até às metodologias analíticas e microbiológicas
utilizadas para se controlar a qualidade, é bastante significativo.
Os microencapsulados avaliados no estudo passaram nos testes químicos e
microbiológicos, podendo ser considerados candidatos a otimização de
microencapsulados de própolis vermelha, com aplicação na área farmacêutica e
alimentícia.

68

REFERÊNCIAS

69

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